피질의 새로운 모델

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 7809(2023) 이 기사 인용

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인간 유도만능줄기세포(iPSC)에서 유래한 인간 피질 오가노이드(hCO)는 인간의 뇌 발달 메커니즘과 복잡한 3차원 조직의 질병을 조사할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 그러나 현재의 hCO 개발 방법에는 정상적인 피질 생성 및 뇌 발달에 필수적인 것으로 밝혀진 주변 수막층과 같은 중요한 비신경 조직이 부족합니다. 여기에서 우리는 먼저 단일 로제트에서 hCO를 생성하여 5일차까지 약 250μm의 일관된 크기로 보다 균질한 오르가노이드를 만들었습니다. 그런 다음 3D 공동 배양 시스템을 활용하여 뇌 막 세포의 얇은 층으로 뇌 오르가노이드를 캡슐화했습니다. 피질 발달의 초기 단계. 다양한 발달 단계에서 다양한 피질층 마커를 표시하기 위해 면역 염색 분석이 수행되었습니다. IncuCyte를 사용한 오가노이드 발달의 실시간 모니터링은 시간이 지남에 따라 형태가 향상되고 성장률이 증가한 것으로 나타났습니다. 우리는 뇌막으로 캡슐화된 오가노이드가 Cajal-Retzius 뉴런에 의해 REELIN의 더 높은 발현을 나타냄으로써 더 나은 층류 조직을 나타낸다는 것을 발견했습니다. 수막 세포의 존재로 인해 TBR2 중간 전구 세포(IPC), 심부 피질층(CTIP2) 및 상부 피질층(BRN2)이 더 크게 확장되었습니다. 마지막으로, 수막 캡슐화된 오가노이드는 각각 HOPX 및 GFAP 마커의 더 강력한 발현으로 설명되는 외부 요골 교세포 및 성상교세포 형성을 강화했습니다. 이 연구는 생체 내 피질 뇌 구조를 보다 밀접하게 모방하고 배아 발달 중 신경 발달 장애의 기본 메커니즘을 더 잘 조사할 수 있는 새로운 3D 공동 배양 플랫폼을 제시합니다.

인간의 뇌는 뉴런, 성상교세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 구성됩니다. 다능성 줄기 세포에서 파생된 현재 대뇌 오가노이드 시스템은 발달 중인 인간 피질을 요약하는 중요한 시험관 내 모델을 제공하여 건강한 상태와 질병이 있는 상태 모두에서 뇌 발달을 연구할 수 있게 해줍니다1,2,3,4,5. 그러나 현재의 시험관 내 모델 시스템에는 재현성과 적용성에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이러한 제한 중 하나는 시작 세포 집단, 배양 조건 및 세포의 자가 조직 특성의 차이로 인해 발생할 수 있는 배치 간 가변성입니다6,7. 이러한 한계를 해결하는 것은 인간 두뇌를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델로 오가노이드를 개발하는 데 중요합니다. 단일 로제트 기반 접근 방식을 도입하면 보다 일관되고 재현 가능한 오가노이드를 생성할 수 있어 초기 뇌 발달 측면을 더 잘 모방하는 보다 균질하고 정의된 오가노이드를 얻을 수 있습니다.

오가노이드 모델의 또 다른 한계는 인간의 뇌에서 볼 수 있는 완전한 세포 다양성이 부족하다는 것입니다8. 오가노이드는 인간의 뇌에서 발견되는 일부 세포 유형을 생성할 수 있지만 모든 세포 유형이 나타나는 것은 아닙니다. 이는 적절한 복잡성으로 인간 두뇌의 발달 및 구조적 측면을 완전히 요약하는 데 필요한 적절한 신호 변환을 제한할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리의 접근 방식은 수막 세포를 뇌 발달에 중추적인 역할을 하는 중요한 세포 유형으로 통합하는 것입니다. 비뉴런 뇌 세포의 일종인 수막은 피질 발달의 초기 배아 단계부터 존재하며 정상적인 피질 생성 및 뇌 구조 형성에 필요한 것으로 보입니다9,10,11,12. 최근 연구에서는 시험관 내 및 생체 내에서 새로운 뉴런을 생성할 수 있는 신경 전구체 마커를 발현하는 수막 내 NSC 집단의 비실질 틈새를 확인했습니다13,14. 뇌 발달 과정에서 수막은 피질 형성에 필요한 다양한 형태 형성 인자를 방출함으로써 hCO 발달에 중요한 역할을 합니다. 시험관 내 연구에 따르면 수막 세포는 적절한 피질 생성에 필수적인 FGF-215, IGF216,17, CXCL1218,19,20,21 및 레티노산22,23,24을 분비할 수 있는 것으로 나타났습니다. 생체 내 연구에서는 또한 수막이 복부 전뇌의 발달에 중요한 역할을 하는 소닉 고슴도치(Shh)와 등-복부 조절을 조절하는 뼈 형태발생 단백질(BMP) 계열을 포함한 다양한 신호 분자를 분비한다는 사실이 입증되었습니다. 신경관의 패턴화25. 수막에서 분비되는 다른 요인으로는 신경 발생을 포함한 다양한 발달 과정에서 세포 증식, 분화 및 생존 조절에 관여하는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 계열인 Wnt 및 Notch가 있습니다. 29. 뇌척수막의 라미닌이 풍부한 영역은 이러한 인자의 방출을 조절하는 데 필수적이라는 가설이 있습니다. 따라서 수막의 존재는 뇌 유기체 발달에 결정적인 것으로 보입니다.

5 × 105 cells in 1 ml volume. HMC were characterized by immunofluorescence; they are all positive for fibronectin and negative for GFAP and α-smooth muscle actin. 5 × 105 cells/ml, were purchased (1 ml/vial) in passage zero, expanded in meningeal cell medium MenCM consisting of 500 ml of basal medium, 10 ml of fetal bovine serum and 5 ml of meningeal cell growth supplement and 5 ml of penicillin/streptomycin (ScienCell catalog #1404) medium and were used up to passage number three./p> 250 µm by day 5 (Fig. 1c). Morphological observation showed well-defined lumen structures in the middle of the rosettes (Fig. 1c, g). Overall, single rosettes had > 1.8-fold increase in size from day 3 to 5 which was shown to be significant (p < 0005). (Fig. 1f). These data were confirmed with two additional iPSC lines (PCDH19 and CHD2). Data from these two lines are shown in (Supplementary Fig. S1). To characterize neural rosette emergence, we conducted a time course analysis on different neural stem/progenitor cell (NPC) markers. Only 2 days after dual SMAD induction, iPSC-derived rosettes started to show expression of neuroectodermal markers PAX6 and NESTIN NPCs and apical membrane marker PKC-Z (Fig. 1e1). At day five, well-defined polarized neuroepithelial-like structure was observed with distinguished expression of PAX6 and NESTIN NPCs in the ventricular zone (VZ) and strong expression of adherent junction markers of N-Cadherin and PKC-Z in the apical region which resembled neural tubes (Fig. 1e2, g)./p> 800µm by day 24 (Fig. 1i). Our approach to generate cortical organoids from single rosettes appears to rapidly produce homogeneous organoids and yield well-defined organized neuroepithelial rosettes./p> 1.5-fold-change) in hCOMs compared to control hCOs (Fig. 3c). Data were analyzed from four separate experiments and a total number of 18 organoids for the CC1 cell line and results replicated with the use of two additional cell lines (PCDH19 and CHD2) in Supplementary Fig. S6. Together, these results show that our novel co-culture system using human iPSCs and meningeal cells together can efficiently enhance the morphology and phenotype of cortical organoid formation and increase their growth in a specific time course./p>

10 cortical structures from 4 independent experiments). Error bars ± SD, all scale bars: 100 µm, (c,d) representative immunostaining images for preplate Cajal-Retzius marker REELIN after 10 weeks in hCOMs and hCOs and quantification of the relative thickness of the MZ area at week 10. For each cortical structure, three measurements were taken at 45° angles to obtain the mean. MZ thickness was statistically significantly expanded after 10 weeks in hCOMs compared to hCOs (p < 0.0005) (n = 4 biological replicates in total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 and n = 1 CHD2, n = 10 number of organoids were analysed). Error bars ± SD, scale bars: 100 µm./p>

3.0.CO;2-D" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1096-9861%2820010226%29431%3A1%3C88%3A%3AAID-CNE1057%3E3.0.CO%3B2-D" aria-label="Article reference 15" data-doi="10.1002/1096-9861(20010226)431:13.0.CO;2-D"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

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