게놈 편집 및 대규모 작업을 위한 다기능 시스템

Nature Communications 13권, 기사 번호: 3430(2022) 이 기사 인용

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CRISPR SWAPnDROP은 게놈 편집의 한계를 박테리아 종 간의 대규모 생체 내 DNA 전달까지 확장합니다. 모듈식 플랫폼 접근 방식은 종별 적응을 촉진하여 다양한 종에서 게놈 편집을 제공합니다. 이 연구에서는 모델 유기체인 Escherichia coli, 빠르게 성장하는 Vibrio natriegens 및 식물 병원체 Dickeya Dadantii에 대한 CRISPR SWAPnDROP 개념의 구현을 보여줍니다. 우리는 크기 제한 중간 DNA 추출 없이 E. coli, V. natriegens 및 D. Dadantii 사이의 큰 염색체 영역의 절제, 전달 및 통합을 보여줍니다. CRISPR SWAPnDROP은 흉터 없음, 마커 없음, 반복 및 병렬 삽입 및 삭제로 구성된 일반적인 게놈 편집 접근 방식도 제공합니다. 모듈식 특성은 DNA 라이브러리 적용과 표준화된 부품의 재활용을 용이하게 합니다. 다색 무삭제 공동 선택 시스템은 편집 효율성을 크게 향상시키고 조립 및 편집 프로세스 전반에 걸쳐 시각적 품질 제어를 제공합니다.

최근 몇 년 동안 기초 연구, 생명공학 및 합성생물학 분야에서 박테리아의 게놈 편집 관련성이 급속히 증가했습니다. CRISPR/Cas9 및 대규모 DNA 합성과 같은 새로운 기술로 인해 광범위한 과학계가 게놈 편집을 할 수 있게 되었습니다. 그러나 대규모 수정, 개별 도구의 비호환성 및 높은 처리량 시스템은 여전히 ​​어려운 과제입니다.

박테리아에서 게놈 편집의 기본 단계는 플라스미드, ssDNA 또는 dsDNA 형태의 외인성 주형 DNA를 도입하고 상동 재조합을 통해 염색체에 후속 통합하는 것입니다. 상동재결합은 λRED와 같은 재조합 시스템으로 개선하더라도 매우 비효율적인 과정입니다. 편집된 세포에 대한 시간 소모적인 스크리닝을 극복하기 위해 항생제 내성 마커 또는 대사 마커 통합과 같은 다양한 전략이 개발되었습니다1,2,3,4. 그러나 마커당 하나의 편집만 가능하므로 한 셀에서 가능한 편집 수는 사용 가능한 마커 수에 따라 제한됩니다. 또한 염색체에 추가 마커 유전자를 도입하면 인접한 전사 단위5,6에 원치 않는 간섭이 발생할 수 있습니다. 마커 제한 문제를 회피하기 위해 Cre- 및 FLP 재조합효소와 같은 부위별 재조합효소를 도입하여 염색체 통합 후 선택 마커를 제거합니다. 이는 편집 과정에 추가 단계를 추가하고 게놈에 활성 재조합 사이트를 남겨두므로 결국 대체 재조합 사이트를 사용하더라도 이 접근법의 적용이 제한됩니다9. 선택 마커 및 기타 흉터를 방지하는 또 다른 전략은 올리고 매개 대립유전자 대체(OMAR)입니다. 짧은 단일 가닥(ss) DNA는 복제 분기점에서 오카자키와 유사한 대립 유전자 대체 이벤트에 의해 게놈에 통합되고 점 돌연변이, 작은 삭제 및 삽입을 촉진합니다10. 이 방법의 자동화 및 순환화는 여러 유전자의 게놈 수정을 허용합니다. 그러나 OMAR은 사용된 ssDNA 올리고의 크기에 의해 제한되므로 더 큰 편집은 불가능합니다.

더 큰 흉터 없는 게놈 편집을 위해 역선택 방법을 적용할 수 있습니다. 이러한 방법은 길이가 18 및 22 bp인 특정 부위에서 이중 가닥 절단을 도입하는 메가뉴클레아제 I-SceI 및 I-CreI와 같은 효율적인 역선택기에 의존합니다. 이중 가닥 절단은 편집되지 않은 세포의 세포 사멸을 초래합니다. 이는 성공적으로 편집된 세포의 생존 가능한 인구를 강력하게 풍부하게 합니다. 그러나 이 접근법에는 메가뉴클레아제의 표적 부위가 관심 부위의 염색체에 먼저 통합되는 추가적인 고전적 편집 단계가 필요합니다.

CRISPR/Cas9의 발견으로 특정 제한 사이트의 초기 통합이 폐지되었습니다. 메가뉴클레아제와 유사하게 Cas9는 엔도뉴클레아제입니다. 메가뉴클레아제와 달리 Cas9에는 DNA 서열 특이성이 없습니다. 특이성은 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA(gRNA)에 의해 매개됩니다. 가능한 표적 부위는 표적 서열의 상류에 위치해야 하는 프로토스페이서 인접 동기(PAM) 서열(5'-NGG-3')에 의해서만 제한됩니다. 단순성으로 인해 Cas9 역선택이 널리 사용됩니다. 유도성 Cas9과 재조합 시스템을 포함하는 플라스미드 시스템은 유전자 결실, 점 돌연변이 및 짧은 삽입을 선택하도록 설계되었습니다. 이러한 시스템은 상동성 재조합을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 또는 선형 이중 가닥 주형 DNA의 변형에 의존하므로 대규모 삽입에는 적합하지 않습니다. 크기 제한을 극복하기 위해 REXER는 에피솜 레플리콘16에 템플릿 DNA를 제공합니다. 최대 100kb의 삽입물은 λRED 재조합을 촉진하기 위해 CRISPR/Cas9에 의해 생체 내에서 절제됩니다. 선택은 양성 및 음성 선택 마커를 통해 발생하며, 이는 통합 사이트에 흉터가 생기고 첫 번째 선택 마커 세트의 이전 통합이 필요합니다.